安吉白茶特异性状的生理生化本质
2000年05月19日 14:26 来源：农博网
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摘要：安吉白茶的特异性主要表现在春季发芽时新梢嫩叶叶色的可逆性白化现象，在白化过程中新梢的叶绿素含量急剧下降和氨基酸含量显著上升。研究表明，安吉白茶是一个温度敏感的自然突变体，其白化表达的温度阈值在20～22℃之间，但该温度仅在芽萌发初期发挥作用；其正常复绿的启动温度在16～18℃之间。叶片白化期的主要生理生化变化是叶绿体膜结构发育发生障碍，叶绿体退化解体，叶绿素合成受阻，质体膜上各种色素蛋白复合体缺失，导致了叶色的变化；RuBP羧化酶的大、小亚基含量及酶活性下降，同时伴随蛋白水解酶活性的升高，终因叶绿体不能继续发育，多余的可溶性蛋白水解，导致游离氨基酸含量显著上升。文中对其返白机理进行了讨论，认为该温度敏感型突变体的突变很可能是由核基因或核质互作控制的。 关键词：安吉白茶 阶段性返白突变 温敏突变体 中图分类号：S571.1 文献标识码：A Physiological and Biochemical Essence of the Extraordinary Characters of Anji Baicha Li Sufang1，Cheng Hao1，Chen Ming1，Yu Fulian1，Yan Jing2，Liu Yiming2，Chen Longan2 1 Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008 2 Forestry Research Institute,of Anji County,Zhejiang Province，Anji 313307 Abstract The extraordinary character of Anji Baicha(Camellia Sinensis) is expressed in the reversible albescent phenomenon of newly sprouting leaf in spring. During its albescence progress, the chlorophyll content of Anji Baicha dropped quickly and its free amino acid level increased evidently. Investigation showed that Anji Baicha is a natural temperature-sensitive mutant. The temperature threshold for albescence was about 20—22℃ and the initiating temperature for reversion was about 16—18℃. The main abnormal conditions in leaf during albescence consist of the lack of various pigment-protein complexes in plasmid membrane, the degeneration of chloroplast membrane structure and the retardation of chlorophyll biosynthesis which resulted in the leaf color change. The decrease of macro-subunit and micro-subunit contents and the activity of RuBP carboxylase accompanied with increase of the proteolytic enzyme activity induces the cease of the development of chloroplast and the hydrolysis of the surplus soluble protein, which ultimately causes the rise of the free amino acid level and the drop of the soluble protein level. The mechanism of this albescent phenomenon was discussed, and regarded that the mutation of temperature-sensitive mutant is probably mutually controlled by the nuclear gene and nuclear cytoplasm. Key words：Anji Baicha Albescent phenomenon Temperature-sensitive mutant 0 前言 1980年8月，在安吉县天荒坪镇大溪村海拔800米的桂家厂发现了一丛树龄逾百年的珍稀茶树：春茶幼嫩芽叶为白色，主脉呈绿色。这一稀有资源的发现，引起了当地茶叶工作者的重视，在安吉县政府的支持下，县林科所采用无性繁育获得成功。此后中国农业科学院茶叶研究所在国家自然科学基金和浙江省自然科学基金的资助下，县林科所等单位的协助下，对这一特异茶树资源进行了综合评价和形成机理研究。 植物中的叶色突变体种类很多，这种在一定条件下叶色变白而又能自我恢复的材料，一般称之为阶段性返白突变。小麦、矮牵牛、樟脑草等高等植物都曾发现过类似的突变［1］。但不同植物上形成阶段性返白突变的机制却不尽相同，如小麦矮变一号中产生的返白突变系属于细胞质控制的温度敏感突变型［2］，而大麦、水稻和矮牵牛中的具有阶段性变白特征的突变体却是由于核基因突变产生的［1，3］。 本文将从安吉白茶的基本特性和返白突变的生理生化来揭示其突变产生的机理，为深入了解这一特异资源和进一步利用开发提供理论依据。 1 返白的两大表型变化 1.1 叶绿素含量下降 安吉白茶特异性的最显著表现是春季发芽时嫩叶的阶段性白化现象。其表现形式为：每年春季新萌发的芽头呈微绿色，而当叶片展开后就很快白化成乳白色。这种白化现象在一芽二叶期前后最为明显，随后叶片的色泽又逐步复绿，颜色也逐渐加深；迟长出的叶片比早长出的叶片优先转绿；而进入复绿阶段后长出的叶片，则不再经过白化阶段，直接为绿色。这种白化的直接原因是叶片中叶绿素含量的起伏变化（表1），而其叶绿素组成没有明显的差异[4]。 表1 安吉白茶返白与复绿过程中的叶绿素含量变化(mg/g.鲜重) Table 1 Variation of chlorophyll content during the albescent process of Anji Bai Cha (mg/g.fw) 年份 Year 返白初期 Early albescent 最白期 Fully albescent 复绿初期 Early recovery 复绿后期 Fully recovery 1993 0.656 0.207 0.859 1.655 1994 0.520 0.455 0.875 1.739 1996 0.199 0.154 0.382 1.029 1997 0.245 0.081 0.575 2.252 1.2 氨基酸含量增加 安吉白茶第二大特点是白化期叶片中的氨基酸含量较高。与色素含量的变化相反，在整个返白过程中，游离氨基酸总量随白化程度的加深而快速升高，而在复绿过程中又随之逐渐降低(表2)。返白期氨基酸总量高峰值可达5%以上，比一般茶树品种的氨基酸含量高出许多。其它生化成分中，茶多酚含量的变化趋势与氨基酸相反，儿茶素组成、总氮水平、咖啡碱和水浸出物含量在不同时期基本无差异。正是由于白化期的高氨基酸含量，使得由该鲜叶原料制成的玉凤茶滋味尤为鲜爽，风味独特。 表2 安吉白茶返白与复绿过程中氨基酸总量的变化（%） Table 2 Variation of total amino acid content during the albescent process of Anji Baicha（%） 年份 Year 返白初期 Early albescent 最白期 Fully albescent 复绿初期 Early recovery 复绿后期 Fully recovery 1994 4.006 5.896 2.390 1.890 1995 3.628 5.038 3.903 1.978 1996* 1.575 1.205 0.293 0.362 *为鲜叶中的含量The contents in fresh leaves 2 返白表达的条件 安吉白茶无性繁育成功后，已经从海拨800 m处大面积引种至浙江省平原和丘陵地区，从表现来看，除受各地气候影响其物候期有所变化及年度间受气温变化影响其白化程度和复绿速度有所不同外，其返白的性状表现基本一致，因而可以认为是一个稳定的突变体。 但安吉白茶返白突变的表达与否是有一定条件的。多年的田间观察表明，安吉白茶的返白表现主要受当年春季生长期温度的影响，如上所述，其返白现象只是在春季茶芽萌发期表现，且随着采摘轮次的增加，其表现减弱，表明其表现特征主要是受萌发期温度的影响。恒温处理实验也证明，其返白现象与环境温度密切相关。如在19℃恒温条件下，能够观察到典型的返白与复绿过程，新生叶片约经过2周的白化期后开始出现复绿迹象，30 d后明显复绿，40 d后叶色已完全回复到正常状态；而当芽萌发时的环境温度达到23℃时，就观察不到这种先白化再复绿的现象；返白突变表达的温度阈值应在20～22℃之间。但这种温度效应也仅表现在芽萌发初期，已经展开的叶片便不再表达。即使将23℃恒温处理下不表现返白现象的茶苗移至15℃环境中，其已展开的绿色叶片不会再有白化表现。 已白化的叶片其复绿速度，同样与温度条件有关。在15℃恒温处理下，白化叶片的复绿速度就十分缓慢，生长至40 d后才出现一丝复绿迹象。如果将15℃环境下的白化茶苗移至23℃，4～7 d后叶片就能明显转绿。自然条件下的观察结果与之相符，如果芽萌发后的气温较长时间处在15℃以下，新生叶片叶绿素含量就会较大幅度地继续下降；反之，如果一芽一叶后日均温度很快稳定通过了15℃，叶绿素含量基本上不会继续下降。各年度的观察表明，叶片最白期时的日均气温如果稳定在15℃以上达10 d时，之后叶片便逐渐开始复绿，而明显复绿开始时的日均气温则均在19℃以上。因此，可以认为，正常复绿的温度条件是15℃以上，复绿的启动温度在大约16～18℃左右。 以上观察结果表明，安吉白茶是一个典型的温度敏感型突变体。另外，观察还表明，光照强度对安吉白茶返白表现也有影响。在日照强烈时，白化程度就会加深，而在遮荫条件下复绿的速度较快；但在同样的光照条件下，不同温度下返白突变仍有表达与否的差别，因此，光照强度不是返白表现的必要条件。 3 返白阶段叶绿体结构解体 前面已述及，安吉白茶返白现象的直接原因是叶绿素含量的下降。但叶绿素含量下降并不是由于叶绿素合成途径中某一步骤受阻而引起的。根椐对返白与复绿过程中各叶绿素前体水平的跟踪测定，从叶绿素生物合成途径中最早的前体物质5-氨基乙酰丙酸(ALA)，经过胆色素原(PBG)、镁原卟啉(Mg-Proto)，直到其较直接的前体物质原叶绿素酸酯(Pchlide)，各种前体在返白与复绿过程中的含量变化趋势都与叶绿素的含量变化基本一致：在白化过程中其含量水平与叶绿素平均同步下降约20%，进入复绿期后又一致上升，至完全复绿后便恢复到对照水平，甚至略高。因此可以认为，安吉白茶的白化现象并不是因为叶肉细胞中叶绿素生物合成途径的某一步骤受阻所致，而是整个叶绿素的生物合成都受阻。 研究表明，叶绿素合成受阻是由于叶绿体结构在白化过程中的不断退化引起的。根据电镜观察，进入返白期后，叶肉细胞叶绿体内基粒结构不断遭到破坏，膜系统逐步解体，至进入全白期时叶绿体结构完全崩溃。开始复绿后，又出现了返白的可逆过程，叶绿体重新出现，其结构迅速重建并恢复到正常状态［5］。对返白过程中叶肉细胞叶绿体分布的观察也证实了叶绿体的这种变化：在返白初期，仅在下表皮以上占叶片1/3厚度的叶肉细胞中含有叶绿体，栅栏组织与海绵组织细胞中都没有叶绿体存在；全白期所有叶肉细胞中叶绿体均彻底消失；复绿初期，叶绿体最早出现在靠近下表皮的细胞中，随后以纵向由下表皮向栅栏组织、横向由叶脉向叶缘推进的顺序逐步恢复，同时侧脉维管束附近出现叶绿体也较早；至完全复绿后，叶绿体在叶肉细胞中的分布恢复正常［6］。 叶绿素生物合成的前半段虽然是在基质中进行的，但需要完整而正常的膜系统为它的正常运作提供稳定的环境，并且其后半段的合成则是直接在膜系统上进行的，因此叶绿体结构的解体使叶绿素合成失去了可依托的物质基础，必然使叶绿素的合成陷于不正常的停滞状态。 4 返白阶段色素蛋白复合体消失 在安吉白茶正常的叶片中可以分离得到4个叶绿素蛋白复合体和1条游离色素带，两条迁移较慢的色素蛋白复合体带在436 nm和675 nm左右各具有1个明显的吸收峰，为P700叶绿素a蛋白复合物(CPI)和2条迁移较快的带，其吸收峰在红光区位于670 nm和651 nm处，而在蓝光区位于438 nm及469 nm处，为捕光叶绿素a/b蛋白复合体(LHCP)。 但安吉白茶全白期叶片中未能检出色素蛋白复合物，只有微弱的游离色素存在。而从微复绿叶中能分离出3种色素蛋白复合体，缺少CPI的寡聚形式(CPIa)，各带颜色较浅，吸收峰高度也较低，表明在此阶段已有色素蛋白复合物但含量较低；随着叶片复绿，在半复绿叶和完全复绿叶样品中均分离得到5条带，且各带吸收峰高度不断上升，表明各色素蛋白复合物含量是随复绿过程逐步增加的。 对色素蛋白复合物中脱辅基蛋白部分的分析表明，全白期CPI是完全缺失的，不仅色素蛋白复合物不存在，而且其脱辅基蛋白也不存在。而对于LHCP而言，虽然蛋白复合物没有，但仍可检出少量LHCP的脱辅基蛋白。而在开始复绿后，脱辅基蛋白的情况与完整色素蛋白复合物的表现完全一致，仅微复绿叶中缺少CPIa的脱辅基蛋白；同时，各种脱辅基蛋白的含量也均是随着复绿的进程而逐步升高的。 5 返白阶段叶绿体功能同时受到严重破坏 1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPcase)是叶绿体进行光合作用时同化CO2的主要酶之一。对安吉白茶返白复绿过程中叶片可溶性蛋白的分析表明，不同时期RuBPcase大小亚基含量有明显差异。安吉白茶RuBPcase 大小亚基分子量分别为54.2 kD和14.9 kD左右，两者含量在白化初期与全白期均处于较低水平，复绿后急剧升高，两个亚基的变化幅度基本相近。而不表现返白突变的有性种子后代的RuBPcase大小亚基在各时期的水平基本没有变化，与白茶复绿期水平接近，大大高于白茶返白期水平，与这些有性后代不表现白化突变的现象一致，说明白茶RuBPcase 亚基的含量变化确实是由突变引起的。 返白过程各时期RuBPcase 酶活性的变化规律与其亚基含量的变化一致，即随叶片返白程度的加深而下降，又随叶片逐步复绿而上升，其变化规律和已观察到的返白复绿过程中叶绿体结构的降解与恢复现象一致，说明返白期叶绿体的结构与功能都同时受到了严重的破坏，而在复绿过程又得到重建的。 6 返白阶段蛋白酶活性升高 对安吉白茶返白与复绿各阶段的蛋白水解酶活性、可溶性蛋白含量和游离氨基酸总量的分析结果表明，在白化阶段，蛋白水解酶活性较高，可溶性蛋白含量较低，两者有较好的负相关性；游离氨基酸总量明显增加，其峰值与蛋白水解酶活性最大值几乎同时出现。复绿后蛋白水解酶活性则逐步降低；可溶性蛋白含量逐步升高，游离氨基酸含量下降。游离氨基酸库容的变化与可溶性蛋白含量变化呈较好的负相关性。 通常，在植物叶片中，RuBPCase 几乎占叶片可溶性蛋白的50%左右，其大小亚基蛋白是植物蛋白酶水解的最佳底物。因此，造成RuBPCase 大、小亚基含量在白化期下降的原因，很可能就是由于叶绿体结构的破坏，使RuBPCase失去了发挥其功能的结构依托，因而诱发了蛋白酶活性的升高，导致了RuBPCase酶蛋白的大量水解。但无论如何，白化期蛋白酶活性的显著上升是其同期氨基酸总量增加的直接原因是可以肯定的。 7 讨论 以上研究结果表明，安吉白茶是一个温度敏感突变体。该品种每年春季叶色突变的产生，是由于新生叶片叶绿体发育对温度条件的要求发生了变化。在温度条件得不到满足的情况下，叶绿体膜的发育出现了障碍，叶绿素合成被阻滞，叶绿体的结构与功能同时受到了严重的破坏，并伴随蛋白水解酶活性升高，将由于叶绿体不能继续发育而多余的蛋白质水解，使游离氨基酸积累。然而，安吉白茶的有性繁殖后代在白化性状上却出现了分离：大多数的后代不再具有返白特征，只有少量植株（约占3%）保持其返白现象。因此，这一突变不会是单纯由细胞质遗传的，而很可能是由核基因或核质互作控制的。 对色素蛋白复合体和RuBPcase的研究，从另一侧面证实了这一推论。植物中CPI的脱辅基蛋白是由质体DNA编码合成的，而LHCP蛋白是由核基因编码在细胞质合成后才输送到质体上的［7］。全白期仍有少量LHCP脱辅基蛋白存在，说明安吉白茶的突变不太可能是由于色素蛋白复合体中蛋白部分的合成受阻引起，LHCP脱辅基蛋白含量的减少可能是由于蛋白被水解所致，而CPI脱辅基蛋白的缺失，则应该是因为叶绿体结构破坏使其合成被中断。 而植物的RuBPcase也是一个由核基因和质体基因共同编码的基因产物，其大亚基的合成由叶绿体基因组中单一基因编码，而小亚基的合成则由核基因组中的多基因编码。如果安吉白茶的返白现象由质体突变产生，则其RuBPcase的变化应该和由叶绿体基因组缺失所导致的水稻花培白化苗相似，而后者的RuBPcase 大亚基水平极低、小亚基较为正常［3］。但安吉白茶在其返白与复绿过程中，RuBP羧化酶大、小亚基含量基本上同时下降与上升，与因核基因突变产生的水稻白绿苗的情况较为相似［3］，因此安吉白茶的返白突变不应该是由于质体基因组突变产生。 8 结论 a)安吉白茶为一温度敏感型自然突变体。白化表现的温度阈值约在20～22℃之间，但低温仅在芽萌发初期发挥作用，而正常复绿的启动温度约在16～18℃之间。 b)白化的直接原因主要为叶绿体膜结构发育遭遇障碍，色素蛋白复合体消失，叶绿素合成受到阻滞，叶绿体退化解体，但叶片色素组成未发现明显变化。 c)伴随叶绿体结构的异常变化，蛋白水解酶活性升高，导致可溶性蛋白含量降低，游离氨基酸含量升高，是安吉白茶特有品质性状的主要成因。 d)安吉白茶的所有这些性状变化均可逆，在复绿过程中可自然恢复。 e)由于叶绿素前体含量的变化趋势都与叶绿素一致，因此该突变体不是由于叶绿素合成途径中某一前体的合成受阻而致。结合其有性后代的表现，安吉白茶应该是一个核基因控制或核质互作控制的突变体。 基金项目：国家自然科学基金与浙江省自然科学基金资助项目内容。
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