日粮铜水平对肉仔鸡生长性能和免疫功能影响的研究
1998年11月06日 14:56 来源：
摘 要 1日龄艾维茵肉仔 鸡120只，随机分组，自由采食以葡萄糖－大豆分离蛋白为主要原料的半纯合日粮，日粮中分别添加0、11和440mg／kg铜，饮用去离子水，分别于1日龄皮下接种HVT冻干苗、7和14日龄滴鼻接种Lasota系冻干苗。试验结果表明，日粮中0或440mg／kg铜添加组与11mg／kg铜添加组相比：19、43日龄体重小（P＜0.05），0mg／kg铜添加组0～43日龄单位增重料耗显著高于11mg／kg铜添加组（P＜0.05）；胸腺、法氏囊和脾脏不同程度地萎缩（P＜0.05），显微分析0mg／kg铜添加组胸腺、脾脏、法氏囊、盲肠扁桃体和哈德氏腺发现，淋巴细胞减少且分布疏松，胸腺淋巴细胞膜和核膜不清晰 ；T、B淋巴细胞对丝裂原的反应性降低（P＜0.05）；血清中NDV、MDV抗体ELISA效价降低（P＜0.05），说明铜对维持机体免疫功能状态必不可少。 关键词 铜，肉仔鸡，生长性能，免疫功能 STUDIES ON EFFECTS OF DIETARY COPPER ON IMMUNE FUNCTION IN BROILER CHICK FED A SOYBEAN-ISOLATED DIET Wu Jianshe1，Guo Yuming2，Yang Hanchun3，Zhou Yuping2 （1．Institute of Animal Husba ndry and Veterinary Sciences， Beijing Academy of Agriculture and forestory Sciences； 2．College of Animal Sciences and Technology，China Agricultural University； 3．College of Veterinary Medicine，Ch ina Agricultural University） Abstract：One hundred and twenty Avian chicks，one day-old，divided into three groups with three repeats per group，were fed ad libitum semipurified diets mainly containing dextrose and isolated soybean protein with addition of 0，11，440 mg／kg Cu in the different group，respectively． Deionized water were supplied．All chicks were inoculated subcutaneously with Marek′s disease virus （MDV）freeze-dried vaccine at one-day-old，also intranasally-intraocularly with Newcastle disease virus （NDV）freeze-dried vaccine at the seventh （primary）and fourteenth（secondary）day-old．The results indicated that the best group was the chicks fed a diet with addition of 11 mg／kg Cu．In contrast to the addition of 11 mg／kg Cu，the body weight of chicks fed diets with Cu added at 0 and 440 mg／kg signifi cantly decreased（P＜0.05） at 19d， 43d，respectively； the feed consumption per gram gain were significantly higher（P＜0.05） with addition of 0 mg／kg Cu from 0d to 4 3d；The thymus， and bursa F．weight declin ed （P＜0.05） at 19d， 43d respectively；The spleen weight at 43-day-old declined（P＜0.05）respectively．Decrements of lymphocytes were found with optical microscope in thymus， spleen，bursa F． cecal tonsils， and gland of Harder of 0 mg／kg Cu added chicks．Indistinct membranes of mitochondria and nuclei were noticed with electron microscope in thymus of 0 mg／kg Cu added chicks．In comparison with the addition of 11 mg／kg Cu，lymphocytes blastogenic responses to ConA or LPS of c hicks fed the diet with 0 and 440 mg／kg Cu added at 19d，43 d decreased（P＜0.05）respectively；ELISA antibody titers to NDV， MDV in serum at 19d， 25d， 31d， 37d， 43d，and 49 d decreased（P＜0.05）respectively．The results demonstrated that copper was necessary for maintaining immune function for chicks． Key word：Copper， Broiler chick， Performance， Immune function 研究铜对肉仔鸡生长性能的影响，主要以玉米-豆粕日粮为基础，如周明荣（1993）［1］、Poupoulis（1976）等［2］。以葡萄糖和大豆分离蛋白为主要原料的半纯合日粮，探讨铜对肉仔鸡生产性能影响的研究很少，国内尚未见有关报道。 铜对动物机体免疫功能影响的研究目前多见于哺乳动物。多数学者认为缺铜导致机体细胞免疫、体液免疫功能降低［3、4］，具体表现为胸腺萎缩、免疫细胞活性降低及对丝裂原刺激应答反应降低、抗体合成受损及抗体效价降低。然而，也有相反的研究报道。Stabel（1993）指出铜营养状况不影响牛淋巴细胞对丝裂原刺激的应答反应［5］。Dove（1991）给饲喂5mg／kg和250mg／kg铜猪注射SRBC，铜添加水平不影响SRBC抗体效价［6］。铜对机体细胞免疫和体液免疫是否有影响，目前观点不一致。 本研究旨在探讨以葡萄糖和大豆分离蛋白为主要原料的半纯合试验日粮中微量元素铜对肉仔鸡生长性能和免疫功能的影响。 1 材料与方法 1.1 试验动物和处理 1.1.1 动物与日粮：1日龄艾维茵商品代雏鸡120只，随机分为3组，每组3个重复。以大豆分离蛋白和葡萄糖为主要原料，再补充纤维素、维生素和微量矿物元素精确配制而成半纯合日粮。0～3和4～7周龄基础日粮营养水平：代谢能分别为12.97和13.39MJ／kg；粗蛋白质分别为22.0％和20.5％；铜含量分别为2.16和1.96mg／kg。铜 添加水平分别为0（1组，铜缺乏组）、11（2组，对照组）和440mg／kg（3组，高铜组），其它矿物质、微量元素和维生素按艾维茵肉仔鸡标准配制成预混剂添加。饲养管理按《艾维茵肉仔鸡饲养管理手册》进行。对照组铜添加量是在参考艾维茵标准（6.5mg／kg）、NRC标准（8mg／kg)和Feedstuffs推荐标准（11mg／kg）的基础上，经 过试验筛选确定为11mg／kg。NRC（1994）公布未成年鸡铜采食五水硫酸铜中毒剂量250～80 0mg／kg，本试验选择11mg／kg的40倍440mg／kg作为高铜组。 1.1.2 动物处理：1日龄鸡每只皮下注射0.2ml HVT冻干苗（含2000蚀 斑形成单位，中监所生产）；7和14日龄每只滴鼻接种Lasota系冻干苗0.05ml（含106 EID50，江西生物制品厂产品）；14日龄法氏囊弱毒苗滴鼻接种。 1.1.3 临床观察与采样：试验期间每日观察鸡群，分别于19、25、31、37、43、49日龄心脏采血并取样分析。解剖鸡取胸腺、脾脏和法氏囊称重，剪取部分连同哈德氏腺和盲肠扁桃体固定处理，作光学显微镜和电子显微镜观察。 1.2 检测指标 生产性能（体重和料重比）；免疫器官重量（胸腺、脾脏和法氏囊重量）；免疫器官铜含量，采用原子吸收光谱法测定，详见［8］；刺激指数（SI），采用3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法全血淋巴细胞转化试验测定，详见［7］；新城疫病毒、马立克氏病病毒血清抗体采用酶联免疫吸附试验（ELISA），即NDV、MDV－ELISA效 价的测定［9］。 1.3 统计分析 试验结果采用SAS统计软件ANOVA法进行方差分析，DUNCAN法进行多重比较。 2 结果与分析 2.1 临床观察及免疫器官病理学解剖和显微分析 11mg／kg铜添加组，鸡生长较快、体重较大、羽毛和骨未见异常。与11mg／kg铜添加水平相比，0mg／kg铜添加水平出现腿骨变形、趾端弯曲、羽毛异常生长、体重降低、免疫器官萎缩。光学显微镜观察，胸腺髓质增宽、皮质缩小，出现打孔现象，皮质淋巴细胞排列疏松；脾脏白髓淋巴细胞减少，部分网状细胞变性坏死，多数中央动脉周围不形成淋巴滤泡，只有少量淋巴细胞分布，红髓增大；法氏囊皮髓质界限不明显，皮质淋巴细胞减少且染色淡，部分网状细胞变性坏死；盲肠扁桃体淋巴细胞排列疏松，不形成淋巴滤泡；哈德氏腺淋巴组织形成差，无滤泡形成，只有散在淋巴细胞分布。电子显微镜观察胸腺淋巴细胞线粒体膜、核膜不清晰。 2.2 体重和料增重比 表1表明，铜添加水平显著影响肉鸡体重（P＜0.05）。2组体重较其它组重，与2组比，1、3组体重均显著降低（P＜0.05）。1组0～43日龄单位增重料耗显著高于2组（P＜0.05），其它组和日龄，增重料耗较2组高，但差异不显著（P＞0.05）。 表1 肉仔鸡体重和料重比 Table 1 Body weight and feed consumption pergram gain of broiler（g，g／g） 组 别 Groups 0～19日龄 0 ～19 day-old 0～43日龄 0～43 day-old 体重 Body weig ht 料增重比 Feed／Gain 体重 Body weight 料增重比 Feed／Gain 1 4 85±21.90b 1.81±0.059a 1012±47.63c 2.30±0.120a 2 528±19.65a 1.71±0.030a 1440±22.74a 1.95±0.130b 3 494±41.00b 1.67±0.120a 1284±43.50b 2.15±0.045ab 注：同一列标有不同字母表示差异显著（P＜0.05）；试验结果差异表示方法下表类同。 Notes：Mean values within columns followed by different superscripts differ significantly（P＜0.05）；The differences of experimental results in following tables was explained in the same way． 2.3 免疫器官重量 表2表明，铜添加水平显著影响免疫器官发育（P＜0.05）。19和43日龄1、3组免疫器官绝对重量与2组比：1组胸腺绝对重量分别降低43.56%和61.61％（P＜0.05）；脾脏绝对重量分别降低16.27%（P＞0.05）和40.00％（ P＜0.05）；法氏囊绝对重量分别降低42.22%和46.58％（P＜0.05）。3组胸腺绝对重量分别降低42.23%和48.05％（P＜0. 05）；脾脏绝对重量分别降低11.63%（P＞0.0 5）和34.59％（P＜0.05）；法氏囊绝对重量分别降低35.56%和36.99％（P＜ 0.05）。19和43日龄1、3组免疫器官相对重量与2组比：1组胸腺相对重量分别降低38.46%和45.36％（P＜0.05）；脾脏相对重量分别降低8.64%和14.06％（P＞0.05）； 法氏囊相对重量分别降低37.06%和23.53％（P＜0.05）。3组胸腺相对重量分别降低44.48%和41.72％（P[ WTBZ〗＜0.05）；脾脏相对重量分别降低4.94%（P＞0.05）和26.56％ （P＜0.05）；法氏囊相对重量分别降低31.18%和29.41％（P＜0.05）。 表2 肉仔鸡免疫器官绝对重量和相对重量 Table 2 Immune organ′s absolute wei ght and relative weight of broiler（g，g／kg） 表示方法 Expressing method 组别 Groups 19日龄 19-day-old 43 日龄 43-day-old 胸腺 Thymu s 脾脏 Spleen 法氏囊 Bursa F. 胸腺 Thymus 脾脏 Spleen 法氏囊 Bursa F. 绝对重量 Absolut e weight 1 2 3 0．89±0．79b 1．58±0．43a 0．82±0．75b 0．36±0．20a 0．43±0．23a 0．38±0．11a 0．52±0．18b 0．90±0．47a 0．58±0．24b 1．67±1．45c 4．35±1．10a 2．26±0．91b 1．11±0．51b 1．85±0．28a 1．21±0．47b 0．39±0．35b 0．73±0．18a 0．46±0．30b 相对重量 Relative weight 1 2 3 1．84±1．63b 2．99±0．81a 1．66±1．52b 0．74±0．41a 0．81±0．44a 0．77±0．22a 1．07±0．37b 1．70±0．89a 1．17±0．49b 1．65±1．43b 3．02±0．76a 1．76±0．71b 1．10±0．50ab 1．28±0．19a 0．94±0．37b 0．39±0．36b 0．51±0．13a 0．36±0．23b 2.4 免疫器官铜含量 表3表明，随着日粮铜添加剂量增加，免疫器官铜含量显著增加（P＜0.05）。 表3 43日龄肉仔鸡免疫器官铜含量 Table 3 The copper contents of immune organ in broiler at 43 days old（μg／g） 组别 Groups 胸腺 Thymus 脾脏 Spleen 法氏囊 Bursa of Fabricius X SE X SE X SE 1 2 3 0.29c 0.94b 2.50a 0.11 0.27 0.21 0.26c 0.84b 2.24a 0.06 0.12 0.20 0.31c 0.98b 2.83a 0.08 0.30 0.24 2.5 外周血T、B淋巴细胞对丝裂原的反应性 表4表明，日粮铜添加水平影响淋巴细胞对丝裂原的反应性（P＜0.05）。从19、43日龄刺激指数（SI）分析，2组较其它组高。与2组比，1组SI（ConA）分 别降低65.40%和67.96％（P＜0.05 ），SI（LPS）分别降低58.26％和63.51％（P＜0.05）；3组SI（ConA）分别降低56.41％和56.99％（P＜0.05），SI（LPS）分别降低57.19％和59.62％（P＜0.05）。 表4 淋巴细胞对丝裂原的反应性SI Table 4 Lymphocytes blastogenic responses to mitogen（ConA or LPS） 组别 Groups 19日龄19-day-old 43日龄43-day-old 刺激指数 SI（ConA） 刺激指数 SI（LPS） 刺激指数 SI（ConA） 刺 激指数 SI（LPS） 1 2 3 68．61b±19．76 198．32a±25．61 86．45b±15．67 39．41b±9．21 94．42a±8．41 40．42b±4．26 58．41b±14．49 182．42a±28．41 78．45b±16．49 32．94b±5．94 90．28a±8．41 36．45b±7．42 2.6 血清中NDV、MDV抗体（IgG）E LISA效价 表5、6表明，铜营养状况对NDV、MDV抗体E L ISA效价有显著影响（P＜0.05），2组NDV、MDV抗体ELISA效价较其它组高（P＜0.05）。1、3组19、25、31、37、43和49日龄抗体ELISA效价与2组比：NDV抗体ELISA效价，1组分别降低3040、2286、1811、1504、1188和1030（P＜0.05），3组分别降低2657、2086、1617、1305、1028和798（P＜0.05）；MDV抗体ELISA效价，1组分别降低2380、1711、1378、1229、1080和949（P＜0.05），3组分别降低1937、1471、1268、1139、970和809（P＜0.05）。 表5 血清中NDV抗体（IgG）ELISA效价（血清稀释倍数－1） Table 5 ELISA antibody（IgG）titers to NDV in serum（reciprocal of serum dilutions） 组别 Groups 19日龄 19-day-o ld 25日龄 25-day-old 31日龄 31-day-old 37日龄 37-day-old 43日龄 43-day-old 49日龄 49-d ay-old 1 2 3 2299c±210 5338a±168 2681b±117 1605b±113 3891a±304 1805b±226 1331b±223 3142a±164 1525b±171 1181b±168 2685b±134 1380b±91 1080b±87 2268a±241 1240b±176 934b±124 1964a±188 1166b±134 表6 血清中MDV抗体（IgG）ELISA效价（血清稀释倍数－1） Table 6 ELISA antibody（IgG）titers to MDV in serum（reciprocal of serum dilutions） 组别 Groups 19日龄 19-day-o ld 25日龄 25-day-old 31日龄 31-day-old 37日龄 37-day-old 43日龄 43-day-old 49日龄 49- day-old 1 2 3 1940c±113 4320a±109 2383b±135 1540b±169 3251a±260 1780b±260 1210b±56 2588a±207 1320b±154 1060b±142 2289a±123 1150b±142 980b±212 2060a±106 1090b±207 851b±70 1800a±70 991b±87 3 讨 论 日粮中铜添加水平显著影响肉仔鸡的生产性能和免疫功能。铜缺乏或过量均使肉仔鸡体重降低，单位增重耗料不同程度增加。铜缺乏组肉仔鸡体重显著降低，这与刘向阳（1995）、Bala（1991）用大鼠及Prohaska（1993）用小鼠研究报道一致［10～12］。铜缺乏导致胸腺和脾脏萎缩，这与Bala（1991）在大鼠上研究结果一致 ［11］。T、B淋巴细胞是细胞和体液免疫的主要免疫活性细胞，通过淋巴细胞转化试验测定T、B细胞对丝裂原反应性（即刺激指数，简称SI）的高低，可说明机体免疫细胞活性 强弱及功能状态优劣，表4结果表明铜缺乏和过量均降低淋巴细胞活性。铜影响T细胞活性，在哺 乳动物报道较多。大鼠缺铜时，胸腺、脾脏T细胞对植物血球凝集素（PHA）、刀豆素A（ ConA）的刺激指数明显降低［13］。喂缺铜日粮，牛T淋巴细胞对丝裂原刀豆素A（ConA）的应答反应降低［14］。喂低铜日粮（0.8mg／kg），猪也降低T细胞对PHA、ConA的应答反应［3］。对铜中毒导致T细胞功能和活性降低目前还未见到有关报道。有关B细胞转化率的研究报道较少，多数报道通过体内特异性抗体效价间接反映B细胞机能状态，近年来有关方面的报道逐渐增多。 血清抗体效价是反应机体体液免疫功能的主要指标。本研究用灵敏、简便ELISA检测肉仔鸡接种疫苗后血清相应抗体效价。表5、6表明，铜缺乏或过量降低肉仔鸡血清ELIS A效价。据报道，低铜儿童（＜5.6mg／kg）血液免疫球蛋白G、A和M（IgG、IgA和IgM）分别比正常儿童降低48.35％，27.59％和40.00％［15］ 。30日龄牛饲喂补铜（11.5mg／kg日粮）半纯合日粮，血清中IgM含量和21天对溶血性巴氏杆菌抗原特异性抗体含量较不补铜组高［5］。对于同一试验，接种几种不同疫苗，相互干扰的可能性依接种疫苗类型、途径和时间间隔等情况不同而各异。比如，接种传染性法氏囊疫苗后再接种其它疫苗，因接种传染性法氏囊疫苗后法氏囊萎缩，影响B淋巴细胞的功能，从而影响其它后接种疫苗免疫效能和抗体效价。本试验在1日龄接种HVT冻干苗，接种HVT冻干苗后该病毒融合于细胞内不干扰7、14日龄接种鸡新城疫疫苗抗体效价的测定。 硫酸铜是标准铜源，其它铜源对免疫功能影响的研究均以硫酸铜为参比物。Saker（1996）研究指出，与补充硫酸铜和未补充对照组相比，牛日粮补充赖氨酸铜、接种流产杆菌菌株，单核细胞氧化猝发（Oxidative burst）和吞噬活性增强，Ⅱ型组织相容性复合体表达改善［16］。有关其它铜源对免疫功能的影响尚未见报道。 关于铜影响免疫功能的机理，目前多数学者认为铜主要通过抗氧化酶系发挥作用。正常情况下，体内产生的超氧阴离子自由基（O－．2）、过氧化氢（H2O2）等强 氧化剂被抗氧化酶系（超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶）及时清除。但是，铜缺乏或过量降低抗氧化酶系活性，导致O－．2、H2O2积累。过多O－．2使NO（内 皮细胞释放的肌肉松驰因子）氧化生成过氧亚硝酸盐直接攻击生物膜发生脂质过氧化，细胞膜结构和功能发生变化，流动性降低，导致细胞机能丧失，免疫机能下降（Palmer，1987）［17］；过多O－．2还使脱水酶铁硫中心铁释放生成Fe2＋攻击DNA链及由 此导致DNA链进一步羟化，结构和功能丧失（Hiraishi，1992）［18］。过多H2O2使Cu＋形成Cu＋O、Cu2＋-OH攻击酶邻近组氨酸残基，使许多酶失活（Sato，1992）［19］；过多O2－．、H2O2 还使还原型谷胱甘肽（GSH）氧化生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），进而反馈抑制谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，使机体清除过氧化物机能减弱而发生脂质过氧化（Meister，1983）［20］。总之，铜以酶的形式参与O2－．清除 并通过抗氧化来保护生物膜结构和功能的完整性，实现免疫调节。 4 小 结 铜缺乏或过量，肉仔鸡生长抑制、免疫器官萎缩、淋巴细胞活性以及接种弱毒疫苗血清相应抗体ELISA效价降低。试验结果说明铜是维持肉仔鸡免疫功能的必需营养元素。然而，有关铜影响肉仔鸡免疫功能的机理有待进一步研究。 作者单位：吴建设 北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100094； 呙于明 周毓平 中国农业大学动物科技学院，北京 100094； 杨汉春 中国农业大学动物医学院，北京 100094） 参考文献 1 周明荣，王金法．铜、锌、锰和硒对肉鸡生长性能和血液中某些生理生化指标影响的研究．畜牧兽医学报，1993，24（5）：412～422 2 Poupoulis C，Jensen L S．Effect of high dietary copper growth and integrity of the chick．Poult Sci，1976，55（1）：113～121 3 Bala S，Lunney J K．Effects of copper deficiency on T cell mitogenic responsiveness and phenotypic profile of blood mononuclear cells from swine．Am J Vet Res，1993，53（6）：1231～1235 4 Hopkins S G，Failla M L．Chronic i ntake of a marginally low copper diet impair in vitro of lymphocytes and neutro philes from male rats despite minimal impact on conventional indicators of copper status．J Nutr，1995，125（10）：2658～2668 5 Stabel J R，Spear J W．Effect of copper deficiency on tissue，blood characteristics，and immune function of calves challenged with infectious bovine rhinotracheitis virus and pasteurella hemolytica．J 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